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文|小昕

编辑|小昕

最近，测定花粉的技术主要是基于对在所谓的花粉收集器中，收集的花粉粒进行显微镜评估，例如Burkard孢子取样器。通常，花粉和其他空气传播的颗粒，如真菌孢子，被收集在粘性的透明聚酯带上，该胶带被安装在具有固定周长的滚筒上7天。然而，微观评估需要熟练的员工，他们只调查随机选择的几个胶带区域。

此外，取样受到当地环境影响的强烈影响，例如，受陷阱附近的单个灌木丛和树木的影响。由于花粉捕捉器的数量有限，必须考虑花粉种类的全球低估。结合显微测定，这些数据代表了建立花粉预报日历的基础。

●○单个花粉粒的飞行时间质谱○●

在第一个实验中，测试了MALDI-TOFMS检测单个花粉粒的灵敏度。对越来越少数量的花粉粒(从<10到1)进行MALDI-TOF分析。

几个重复测量的相应内插和背景处理的平均质谱如图一所示。有时，注释的峰质量偏移2m/z可以观察到，可以排除花粉粒大小的影响。在具有可变源设计的MALDI仪器上进行的附加实验证实了这一点。

如图一所示，对于每个植物物种(欧洲榛, 梭罗，以及樟子松)，获得了在不同质量范围内具有单独峰模式的质谱。的光谱欧洲榛在以下位置显示强烈的峰值m/z2944和4106，以及之间的特定峰模式m/z5200和6894的光谱梭罗，在以下位置显示四个强烈的峰值m/z3444，5210，5602和6884。

与这些物种的光谱相比樟子松显示强度较低的峰，并且大多数峰可以在较低质量区域(m/z3947–4658)。这些结果与我们以前发表的数据非常一致，在这些出版物之一中，我们试图通过MALDI-TOFMS/MS断裂分析来阐明这种分子分类器的结构，获得了可归因于糖单元(例如，己糖、岩藻糖、戊糖和唾液酸)的典型模式。

然而，质量大于m/z3000(代表花粉光谱中的大多数)是不可行的，在一项详细的研究中，通过MALDI-TOFMS鉴定质量范围从m/z530至548，在a中发现了较高质量的孢粉素m/z同样使用MALDI-TOFMS的4400–4800区域。

其他分子分类器(如聚糖、脂质、肽和蛋白质)的更详细分析需要额外的生化分析(如使用胰蛋白酶消化)和使用LC-MS/MS技术。为了欧洲榛和梭罗样品，甚至一个单独的花粉粒显示相同的特征峰模式，而根据樟子松光谱显示强度较低且特征信号较少。

随着花粉粒数量的增加，光谱显示峰值强度增加，伴随着背景噪声的减少。特别是在低质量范围内的噪声信号可能是基质和磁带干扰的结果。

此外，在更高的质量数范围内，可以看到额外的小峰m/z9000到12000使用更高量的花粉粒(>10个花粉粒)。因此，花粉的欧洲榛和梭罗在单个花粉水平显示物种特异性峰模式。然而，所有三种物质的平均光谱的峰被用作以下成像实验的参考。

●○花粉粒混合物的MALDI-TOF成像质谱(分辨率100微米)○●

在接下来的部分中，通过MALDI成像MS应用100μm的空间分辨率，研究了一组分别具有10、5、3和1个花粉粒的三个物种的花粉粒混合物。因此，空间分辨率由点到点的距离设定，直接观察照片中的单个花粉颗粒是不可行的，因为颗粒尺寸太小，导电带上使用的胶水反射太多，另一个原因是颗粒被一滴基质所覆盖，这一步也会导致花粉在飞沫中的错位。

在图中，显示花粉样本混合物(每个样本有10粒)的选定成像区域的图像。光谱记录在由点象征的位置，如上所述预处理获得的数据集，并应用HCA将数据集分类成相似光谱的组。

考虑用于产生聚类1的光谱的注释峰，这个簇包含来自所有三个花粉物种的信息。相比之下，在聚类2和聚类3中的平均光谱之间可以看到更多的差异。聚类2中的平均光谱显示了桤木更具种特异性的峰模式，而聚类3中的光谱更类似于榛属的花粉光谱。

通过将这些结果与HCA图像进行比较，桤木花粉粒的富集可以假设在图像的中心(红色)，而榛属花粉粒(蓝色)更多地位于右侧。聚类4，主要由低信噪比的光谱组成，代表花粉提取物和背景之间的过渡区域(深灰色)。

在接下来的实验中，花粉粒的数量有所减少。由每种五粒谷物组成的混合物的评估结果见图中的补充部分第四心音。簇1、2和4的光谱显示物种特异性峰模式(蓝色、紫色和红色)，而聚类3主要包含噪声信号。

通过比较聚类和聚类的光谱，可以识别不同的特定峰，而聚类2包含另外两个聚类的光谱信息的混合。簇的平均频谱类似于榛属参考光谱。在簇2的平均光谱中，峰值在m/z4106可以归因于榛属物种。

同时，峰值在m/z4660可以归因于松果体，峰值出现在m/z3446和m/z6888与峰匹配良好赤杨皮参考光谱。最后，簇的平均光谱与参考一致梭罗光谱。

从相应的图像(图第四心音c)，我们推断花粉粒主要分布在样品的底部。在这里榛属花粉提取物位于图像的左侧(蓝色)，而一个非常局部的分布(400×200微米)的赤杨皮花粉(红色)可以在榛属花粉提取物。此外，右手边的区域被分类为上述花粉提取物的混合物(聚类2)。

用进一步减少的花粉粒数量(每种3个)进行的实验数据如图所示表面抗原-5。数字表面抗原-5a包含115个点，每个点代表一个质谱。由于图像光谱中记录的分子信息，单个光谱被分成四组(图表面抗原-5b和表面抗原-5c)使用HCA。

与之前的成像实验相比(图第四心音)，平均光谱中存在较少差异(图表面抗原-5b)。聚类1包含大部分背景信号，而在聚类的光谱中，存在许多不同的峰，这些峰也可以在聚类3中以更高的强度被特别发现。

最后，在簇的平均光谱中，质量范围中的峰模式m/z4500–5000可见。如图2中的参考光谱所示聚类的注释峰标志着花粉粒和背景之间的过渡区，而聚类可以被归属于欧洲榛光谱，我们假设在图中的蓝域(400×300微米)表面抗原-5c图像(聚类3)，榛属花粉粒是存在的。

另一个用每个物种的一个花粉粒进行的实验如图所示。四个团簇的平均HCA光谱显示出高度的相似性，这使得不同花粉物种的区分更加复杂。在大多数情况下，注释峰与参比光谱的峰不匹配。

到目前为止，我们已经表明花粉颗粒混合物的MALDI成像是可能的，并且可以获得具有可靠峰信息的光谱。记录的峰模式可通过HCA进行区分，并直观地归属于参比光谱。此外，我们证明了MALDI成像MS实验的HCA对于更大量的花粉(>5个花粉粒)是合适的工具，但是在单个花粉的分析中失败了。这里，关键的一点是分离花粉粒、花粉提取物和背景簇的测量数据。

正如最近所评论的，为了确定分子图像的质量，成像MS中的空间分辨率是重要的，为了从花粉粒周围的提取物中收集尽可能多的信息，并更好地区分彼此相邻的不同物种的花粉粒，横向分辨率降低到50μm。此外，为了分析数据，除了通过HCA分类之外，还应用了PCA。

●○花粉粒混合物的MALDI-TOF成像质谱(分辨率50微米)○●

图3a中所示的图像是在50微米的较高空间分辨率下获得的(见比例尺),应用于含有花粉样品混合物(每个样品有5粒)的新样品点。由于较高的分辨率和较低的样品量，在导电带上测量的几个光谱仅包含背景信号。

如图所示，获得该混合物的631个光谱，在HCA中总共形成9个簇。所有包含噪声光谱(631个中的535个)的聚类被合并(聚类1–5，图3b)。

图中的第二组3b总结了显示光谱相似性的两个单独聚类(聚类6+7)的信息。在这里，可以观察到不同物种的混合峰模式以及噪声信号。此外，两个具有峰特征的簇榛属(第8组)和赤杨皮(聚类9)可以通过HCA来区分(图3b)。

图3c显示了相应的HCA图像，表明将每个光谱分配给其中一个聚类。这里，背景光谱的位置用灰色表示(聚类1-5)的位置榛属花粉光谱以蓝色着色(聚类8)，而分配给赤杨皮花粉粒显示为红色(簇9)。紫域是从簇6和7的光谱中获得的，其中不同的物种特异性信息难以分配。这些区域应该含有几种花粉的稀释提取物。

最初报道了将MALDI成像MS数据与HCA和PCA的组合相结合以获得组织材料的2D和3D信息的适用性。因此，除了我们之前显示的HCA(图3a–c)，对同一数据集执行PCA。展示了类似的五氯苯甲醚得分图数据。根据我们的数据，前三个主成分(PC)的载荷如图所示，显示PCA得分的适当的正和负图像。此外，在加载图中，给出了每个分量代表的总方差的百分比。

在加载图中(图3d)pc1(负载荷值)和PC2(正载荷值高达m/z5000，并且在某种程度上也包括光谱区域中的负负载值m/z2500)，可以发现主要由背景信号组成峰值模式。相反，PC3的正和负负载信号显示物种特异性信号。

这里，正负载值，例如峰值在m/z3446、5212和6886，可以分配给赤杨皮，而负荷载值为m/z2942、4100和6108专用于榛属光谱。因此，PC3的正面和负面得分图像如图3e显示了两个不同的区域赤杨皮或者榛属出现了花粉粒。

MALDI-TOF质谱的灵敏度足以分析各种物种的单个花粉。此外，花粉混合物的MALDI成像已被证明是检测和鉴定混合物中单个花粉粒的合适方法。

我们还可以证明，更好地覆盖选定的成像区域(可以通过更高的空间分辨率(更小的像素尺寸)来实现)对于更高的灵敏度是必要的。由于图像光谱包含复杂的信息，多变量评估对于成功的分离和鉴定是必不可少的。

使用层次聚类分析(HCA),可以根据总体光谱差异将光谱分成不同的聚类。平均聚类光谱与单独测量的花粉光谱的视觉比较提供了不同光谱特征的第一个细节。

通过将聚类信息与每个光谱各自的空间位置相结合来实现花粉粒的定位。执行PCA支持并确认了分配。此外，记录的成像光谱相对于方差加权PCA空间中的参考光谱的分类另外使得能够独立识别混合物中的花粉粒。